Próbki, które uzyskano we wczesnych punktach czasowych (tj. Po regeneracji po indukcji i cyklach konsolidacji) były w większości próbkami krwi obwodowej, ponieważ ocena szpiku kostnego była traktowana priorytetowo dla cytometrii przepływowej. W fazie opracowywania tego badania (od kwietnia 2009 r. Do maja 2012 r.) Klinicyści nie zostali poinformowani o stanie minimalnej choroby resztkowej, aby można było wiarygodnie ocenić jej wartość prognostyczną. W czerwcu 2012 zaobserwowaliśmy, że nawrót molekularny był związany z postępem choroby. Od tego czasu prospektywnie analizowaliśmy próbki kontrolne i natychmiast informowaliśmy klinicystów o wynikach. Pacjenci, którzy zostali zatrudnieni w okresie od czerwca 2012 r. Do grudnia 2014 r., Stanowili kohortę walidacyjną.
Badanie AML17 zostało zatwierdzone przez Wales Research Ethics Committee 3. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.
Amplifikacja transkryptów zmutowanych NPM1
Ryc. 1. Ryc. 1. Wykrywanie minimalnej choroby resztkowej za pomocą analizy zmutowanych transkryptów NPM1. Mutacje NPM1, które zidentyfikowano u 346 pacjentów w próbie AML17 służyły jako cele do śledzenia minimalnej choroby resztkowej za pomocą ilościowej łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkryptazy. testy reakcji (RT-qPCR) ze starterami zaprojektowanymi do amplifikacji różnych zmutowanych transkryptów NPM1. Mutacje zidentyfikowane w centralnym badaniu molekularnym11,28 zostały potwierdzone w amplifikacji PCR i sekwencjonowaniu Sangera. Wszystkie mutacje NPM1 (czerwone) wystąpiły w eksonie 12 i spowodowały wprowadzenie siatki czterech par zasad. Trzy najczęstsze mutacje (typy A, B i D) stanowiły 90% przypadków. Rzadkie lub unikalne mutacje stwierdzono w pozostałych 10%. Na podstawie testu opisanego przez Gorello i współpracowników 16 wspólny starter i sonda (purpura) połączono ze specyficznym dla mutanta odwrotnym starterem, aby wykryć minimalną resztkową chorobę. Dodatkowe szczegóły podano w tabeli S1 w dodatkowym dodatku 1.
W celu amplifikacji zmutowanych transkryptów NPM1, przygotowaliśmy komplementarny DNA z całkowitego RNA, jak opisano wcześniej. Wykryliśmy minimalną chorobę resztkową w ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR) 16, stosując starter specyficzny dla mutacji ze wspólnym starterem i sonda (rysunek i tabela S1 w dodatkowym dodatku 1). Aby wykryć rzadkie mutacje, zaprojektowaliśmy specyficzne dla pacjenta primery (Primer Express, Applied Biosystems). Testy przeprowadzono trzykrotnie na platformie ABI 7900 (Applied Biosystems), a zmutowane poziomy transkryptów porównywano z ekspresją genu referencyjnego ABL1 przy użyciu standardów plazmidowych (Qiagen), z metodą progów różnicowych w cyklu stosowaną do rzadkie mutacje.29 Testy przeprowadzono w warunkach PCR zaproponowanych przez program Europe Against Cancer (EAC) 30, z wyjątkiem temperatury hybrydyzacji, która została dostosowana w celu wyeliminowania wzmocnienia tła (Tabela S1 w Dodatkowym dodatku 1). Próbki kontrolne z progami cyklu ABL1 wynoszącymi 30 lub więcej zostały wyłączone z analizy. Pozytywność RT-qPCR dla zmutowanego NPM1 zdefiniowano zgodnie z amplifikacją w co najmniej dwóch z trzech powtórzeń z wartościami progowymi cyklu wynoszącymi 40 lub mniej (z zastosowaniem ustawienia progowego 0,1), zgodnie z kryteriami EAC.30
Sekwencjonowanie całego egzaminu, profilowanie molekularne i cyfrowa reakcja PCR
Biblioteki genomowego DNA, które zostały przygotowane przy użyciu systemu wzbogacania celu SureSelectXT Human All Exon V4 (Agilent Technologies) zostały zsekwencjonowane na platformie Illumina HiSeq 2000 z 100-bitowymi odczytami z parami parzystymi
[podobne: Wąsonogi, nutraceutyki, serwis niszczarek ]
Powiązane tematy z artykułem: nutraceutyki serwis niszczarek Wąsonogi